金沙国际官方网址

金沙国际官方网址 3
金沙国际官方网址乐高公司牵手Tencent 联合推系统性小孩子数字消除方案
图片 3
18岁青海男孩赴湖北寻母 分别十载终相认

北京药品所发展稳固抗体药物偶联物新宗旨及抗体糖工程技术方案

7月27日,中国科学院上海药物研究所黄蔚课题组在《自然》(Nature)子刊Nature
Protocols
发表了题为Chemoenzymatic synthesis of glycoengineered IgG
antibodies and glycosite-specific antibody-drug conjugates

的文章,报道了利用化学-酶催化方法制备糖工程抗体与基于糖链的定点抗体药物偶联物的新策略。

图片 1

摘要:质谱技术是抗体药物剖析最重要的技术伎两之一。本文简述了抗体药物的展开和质谱技术的原理。关于质谱技术在抗体药物的剖析中应用中止了归类整理,主要分为在一级构造和高级构造剖析中的应用。一级构造的剖析包括:准确分子量的测定、抗体药物偶联比、肽指纹图谱等,高级构造的剖析包括:氢/氘交流质谱、二硫键的剖析等。质谱法相关于其他剖析办法能够提供更为精确的数据,并能够得到多程度的剖析结果。

抗体类生物药物在治疗肿瘤、自身免疫等疾病方面占据重要地位,其中抗体Fc区域N-糖链通过参与免疫细胞表面Fc受体识别,在抗体的免疫调节机制如抗体依赖细胞毒作用和补体依赖细胞毒作用等方面发挥重要作用。黄蔚课题组在前期发展的抗体糖工程改造技术基础上(Org.
Biomol. Chem.
2016, 9501; J. Am. Chem. Soc. 2012,
12308),利用一类糖苷酶及其突变酶的转糖基化活性,“一锅法”实现抗体的糖基化单一结构控制,优化抗体药物疗效。同时在抗体糖工程化基础上,在糖链底物上引入标记基团,实现小分子毒素药物的定点偶联,为新型抗体药物偶联物的设计提供了新的定点策略。

抗体-药物偶联物通过合成接头共价结合细胞毒性化学物质组成,不仅具有高度细胞毒性的小分子药物的抗肿瘤效力,也结合了mAb的高选择性,稳定性和有利的药代动力学特征。在本综述中,讨论了ADC开发中的抗原靶标选择,临床阶段ADC中使用的弹头,接头的设计和优化,抗体的选择和优化,位点特异性和替代共轭化学,以及增强效力的策略,包括非肿瘤学ADC

关键词:抗体药物质谱一级构造高级构造单克隆抗体药物的展开来源于1975年,Kohler
和Milstein创建杂交瘤技术,为大量制备鼠源单克隆抗体提供了技术条件,创始了大范围制备单克隆抗体时期。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物,能够和靶抗原特异性分别,并且愈加平安有效,所以在恶性肿瘤、本身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排挤等严重疾病上得到了快速的展开,是当前生物药物范畴增长最快的一类药物。[1]1.抗体药物展开新趋向在生物药物范畴,抗体药物占领着越来越重要的位置,2015年全球销售排名前10
位的药物中有6个为抗体药物,分别是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin。抗体药物按来源分类能够分为:鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。鼠源单克隆抗体是第一代的抗体药物,经过不时改造过渡到全人源单抗。目前,FDA批准的单克隆抗体药物中,人源化单抗和全人源单抗数量已占领72%[2]1.1抗体药物偶联物抗体药物偶联物由单克隆抗体和小分子化合物两局部组成,小分子化合物通常是毒性很强的抗肿瘤小分子药物。经过抗体的靶向作用,ADC的抗体局部和肿瘤细胞外表抗原特异性辨认并分别,经过细胞内吞作用,将抗体和小分子化合物一同带进肿瘤细胞内部,并在细胞内部发作水解反响,释放出小分子化合物,从而杀死肿瘤细胞。[3]这样既能够降低小分子药物的毒性,同时具有靶向分别的作用。曾经上市的两个ADC是Kadyla和Adcetris。1.2双特异性抗体双特异性抗体是含有两种特异性抗原分别位点的人工抗体,能在靶细胞和功用分子之间架起桥梁,激起具有导向性的免疫反响,现已成为抗体工程范畴的热点。由于基因工程的展开,目前双特异性抗体曾经研发出多品种型[4],主要类型有三功用双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体、DVD-Ig
等多种方式。2014年第一个双特异性抗体Blinatumomab获FDA批准,靶向位点是CD19和CD3。2.质谱技术近年来质谱仪性能的显着改良主要基于开发出的两种离子化技术:一种是介质辅助的激光解吸/离子化(matrix-assisted
laserdesorption/ionization.MALDI)
[5]技术。另一种是电喷雾离子化(Electrosprayionization,ESI)[6]技术。由于这两种电离技术的呈现,使本来只能检测小分支的质谱技术,能够运用于检测生物大分子。MALDI和ESI两种离子化办法都是软性离子化法,可以使生物大分子在离子化过程中的坚持完好性,剖析灵活度都极高,对低浓度的生物大分子样本也有很好的检测效果。目前,高效液相色谱电喷雾质谱仪联用(HPLC-ESI-MS)及飞行时间质谱仪(HPLC-ESI-TOF)联用已成为蛋白质组学实验中最常用的质谱技术。经过质谱技术能够得到肽指纹图谱,并经过与二维电泳的联用剖析蛋白质。往常这项技术越来越多的应用于抗体药物剖析中。与其它抗体办法相比,质谱剖析具有精确性高、灵活度高、剖析时间短和应用范围广的优势,但是由于质谱仪器高额的本钱限制了其展开。在过去质谱技术主要运用于对一级构造和序列的表征,而往常质谱技术越来越多地运用于高级构造的剖析,而高级构造关于抗体药物的生物活性至关重要。过去只需关于小分子药物,质谱能够中止定量剖析,关于大分子蛋白只可以中止定性剖析,而往常生物质谱不时展开,往常曾经能够中止半定量剖析,置信在不久的将来生物大分子的定量剖析也能够完成。3.质谱技术在抗体药物一级构造剖析中的应用3.1完好抗体药物准确分子量测定当得到抗体药物时,能够直接经过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS中止分子量的检测。经过关于脱糖后分子量的检测,能够关于抗体药物中止初步定性剖析,并将能够作为药物常规放行的剖析办法[7]。关于脱糖前的抗体药物中止剖析,能够得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化程度的散布[8],关于快速理解消费工艺与药物质量的关系具有非常重要的意义。该办法能够关于样品的分子量中止快速检测,适用于工艺过程样品的快速检定。3.2药物抗体偶联比关于赖氨酸链接的抗体偶联药物,采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品中止剖析,依据偶联不同数目药物分子的质量数增加判别偶联数目[9]。关于半胱氨酸链接的抗体偶联药物,应用反相色谱
串联质谱,测定药物抗体偶联比[10]。关于质谱测定的结果,不只能够给出确切的药物抗体偶联比值,更可以给出链接不同个小分子药物的散布状况,及反响过程副产物空链接头的散布状况。[11]该办法能够得到更为精确的小分子散布信息,和UV-DAR办法相比更为精确。

抗体药物偶联物通过将小分子毒素共价连接到抗体上,利用抗体对肿瘤表面抗原的高特异性识别,靶向输送小分子药物。传统的ADC采用随机偶联方法将小分子偶联至抗体赖氨酸或半胱氨酸,在偶联小分子数量和位点等方面存在不均一性,为ADC药物的质量控制、PK/PD稳定性等带来困难。采用糖工程技术的糖链定点ADC药物,克服了随机偶联的不均一性,不仅在小分子偶联位点和数量上高度可控,而且将抗体多组分糖链结构转化为单一组分,实现了ADC分子的高度均一性,为ADC药物设计和成药性优化提供了结构优势。

开发癌症ADC的一个主要问题是确定和验证mAb组分的足够的抗原性靶标。抗原选择中需要考虑几个因素。首先,理想的目标抗原在肿瘤中具有高表达水平,在正常组织中很少或没有表达,或至少表达限于给定组织类型,以减少ADC靶内毒性及导致可接受的治疗指数。第二,目标抗原应存在于细胞表面,以便循环的mAb可进入。第三,目标抗原应该是内在抗原,使在结合后,ADC被转运到细胞中,细胞毒性剂可以发挥其作用。

图片 2图1:抗体偶联物去卷积化前后图谱[9]3.3肽指纹图谱蛋白被特异酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列,蛋白质被酶水解后,产生的肽片段也各不相同,肽混合物的质量数医具有指纹特征[12]。能够经过LC-ESI-MS中止肽片段的一级质量数的审定,也能够经过LC-ESI-MS/MS关于每个肽片段中止进一步确证,进步肽指纹图谱的精确性。关于抗体药物,能够关于应用质谱关于特征的氨基酸序列中止表征,定位在液相中的出峰时间,作为特征峰能够关于抗体药物中止有效的鉴别。该办法适用于终产品的放行审定,固然检测时间比拟长,但是关于样品的鉴别比拟全面而精确。3.4翻译后修饰研讨蛋白质的翻译后修饰关于抗体药物的生物学功用非常重要。常见的翻译后修饰有:磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N端焦谷氨酸环化,C端赖氨酸[13]切除等。普通特定的氨基酸的翻译后修饰,会给该氨基酸残基质量数的增加或者减少。如磷酸化会增加80Da;脱酰胺会减少1Da等。因而,只用质谱剖析仪检测蛋白和肽片段的分子量倾向,能够完成高灵活、高通量和高准确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的品种。[14]应用质谱同时能够对每个位点的修饰比例中止相对定量,从而能够比拟不同批次之间药物的差别性,也能够用于关于早期细胞菌株的选择。[15-17]相比拟于传统的HPLC检测办法,质谱法不只能够得出整体翻译后修饰的程度,也能够得到关于单个氨基酸程度的修饰程度。3.5测定抗体药物降解产物简直一切的蛋白降解产物和本来的蛋白都存在分子量的差别,质谱能够检测分子量的差别,从而检测这种降解产物。但是关于分子量超越20ku的大分子量的蛋白质.质谱的分辨率不够,不可以检测微小的分子量的改动。因而通常是由肽谱图和质谱来共同肯定蛋白质的降解产物。将蛋白质酶解后的碎片用ESI-MS可找出与未降解蛋白质碎片的不同,来确证蛋白降解产物。[18]相比拟于HIC-HPLC,质谱法不只能够得出解说产物的比例,还能够得到解说产物的类型,关于剖析蛋白质的构造变化具有非常重要的意义。3.6N端氨基酸序列检测常规N端氨基酸检测用Edman
降解法中止检测,但是抗体药物有时分会呈现N端环化的现象,在这种状况下用Edman降解法需求先对平面中止去封锁处置,但去封锁的效率直接影响N端测序结果,而直接运用质谱能够直接测出N端的氨基酸序列,同时能够检测出N端环化的相比照例。[19]4.质谱技术在抗体药物高级构造剖析中的应用4.1氢/氘交流质谱常规的质谱只能取得蛋白的一级构造信息,关于蛋白的高级构造无法中止深化的研讨。氢/氘交流质谱能够中止蛋白质构象,溶液动力学和表位映射中止剖析。在一个典型的实验中,将蛋白质复合物放在D2O中不同的时间,使H和D中止交流。然后在强酸性条件及低温下将反响淬灭。将这种状态下的蛋白用特异性的蛋白酶中止酶切,将酶切的肽段经过nanoUPLC-MS剖析,以评价各肽段的氘化程度。分别用离子淌度作为额外的分别伎两能够进步序列掩盖率。在可以调查的蛋白质的高阶构造和动态构造技术中,HDX-MS曾经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体-抗原复合物的构象剖析。例如应用HDX-MS,一个完好的糖基化的IgG1相关于其去糖基化的蛋白的相比,显现出糖基化如何影响的IgG1构象。[20-22]4.2离子淌度质谱法。离子淌度是依据蛋白的电荷和外形选择性分别的办法,能够辨别相同分子量的蛋白和肽段,可用于检测蛋白的简单高级构造。IM-MS能够是一个适用的质谱表征的办法,由于它能够取得蛋白常规的高级构造,比方说蛋白是线性还是球形的,这在IM-MS中能够有很好的辨别。[23]4.3高分辨率傅立叶变换离子回鏇共振质谱高分辨率傅立叶变换离子回鏇共振质谱可以检测最高质量数的质谱仪器,并且有着很高的分辨率。FTICR-MS是目前被公以为是蛋白质组学研讨的有力工具,特别是和完好的蛋白质审定和上/下调翻译后修饰蛋白质的审定。这预示着由FTICR-MS表征分子量很大的蛋白复合物,如完好的免疫球蛋白(IgA的二聚体或IgM五聚体),以及诸如抗体-
抗原复合物的蛋白复合物。这是普通的质谱检测仪不具备的。[24]4.4电子转移解离检测二硫键错配。二硫键的正确配对是维持蛋白高级构造的重要条件,当然蛋白质中也存在错误折叠的蛋白。经典的MS的办法依赖于比照恢复和非恢复样质量谱图,间接证明二硫键的存在。衔接有二硫键的肽段通常是比拟长的肽段,假定运用普通的裂解方式不可以得到较好的离子碎片。而在ETD的方式下,能够得到较好的离子碎片,中止二硫键的剖析。运用LC-MS办法加上线性离子阱ETD仪,以肯定蛋白的二硫键。[25-27]4.小结随着抗体药物的不时展开,需求关于抗体药物的构造信息不时中止深化的剖析,质谱技术也随着这一央求不时进步。在现阶段,由于生物质谱剖析的本钱很高,并且关于人员的央求比拟高,所以使其应用遭到了限制。除此之外,关于质谱剖析的样品必需坚持低盐的缓冲体系,而大局部蛋白样品必需在高盐的体系中才干比拟稳定,所以关于蛋白样品的前处置也非常复杂。当然随着技术的进步,能够预见质谱剖析会越来越多地运用于抗体剖析中,特别是在高级构造剖析的范畴,现阶段关于高级构造的剖析只需传统的生物学活性的办法,经过质谱剖析,能够让我们更多取得高级构造的信息,这关于抗体药物的剖析是极为重要的。此外,现阶段的质谱剖析只是半定量的结果,置信经过技术的展开,能够逐步转变为绝对定量的剖析。参考文献[1]王兰,誅磊,徐刚领,等-单克隆抗体类生物治疗药物研讨停顿[J]-中国药学杂志,201449:2058-2064-[2]李壮林,姚雪静.
单克隆抗体药物研讨停顿[J].药物生物技术,201421:456-461.[3]Austin
CD,Wen X,Gazzard L,et al. Oxidizing potential ofendosomes and
lyosomes limits intracellular cleavage ofdisulfidebased antibody-drug
conjugates[J]. Proc Natl
AcadSci,2005102:17987-17992.[4]Kontenrmann,R. Dual targeting
strategies with bispecificantibodies[J].
Mabs,20124:182-197.[5]Vestal M L,Juhasz P. Delayed extraction
matrix-assisted laserdesorption time-of-flight mass
spectrometry.[J].Rapid Commun MassSpectrom,19959:1044-1050[6]Tisato
F,Bolzati C,Porchia M.Contribution of electrospray massspectrometry
for characterization,design,and development of nitridetechnetium and
rhenium heterocomplexes as potentialradiopharmaceuticals[J]. Mass
Spectrometry
Reviews,PublishedOnline,200423:309-332.[7]李萌,于传飞,王馨,等.
相对分子质量测定作为单抗药物常规放行剖析办法的可行性商榷[J].药物剖析杂志,201512:2076-2082.[8]Zhu
L, Guo Q, Guo H, et al.Versatile characterization ofglycosylation
modification in CTLA4-Ig fusion proteins by liquidchromatography-mass
spectrometry. [J].MAbs.2014;6:1474-1485.[9]于传飞,李萌,郭玮,等.
一种抗体药物偶联物中药物抗体偶联比的测定[J].
药学学报,201403:363-367.[10]于传飞,王文波,张峰, 等.
一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物的药物抗体偶联比测定[J].中国新药杂志,201520:2336-2340.[11]Wakankar
A Chen Y,Gokarn Y,et al. Analytical methods for physicochemical
characterization ofantibody drug conjugates. [J]. MAbs.
2011;3:161-172.[12]Allen D, Baffi R, Bausch J, et al. Validation of
peptidemapping for protein identity and genetic stability. Biologics
andbiotechnology section, pharmaceutical research and manufacturers
ofAmerica.[J].Biologicals.1996;24:255-275[13]Duan X T,Dai L P,Chen
S C,et al- Nano-scale liquidchromatography/mass spectrometry and
on-the-fly orthogonal arrayoptimization for quantification of
therapeutic monoclonalantibodies and the application in preclinical
analysis. [J]- JChromatogr A,20121251 :63-73-[14]Stackhouse N,
Miller AK, Gadgil HS. A high-throughput UPLCmethod for the
characterization of chemical modifications inmonoclonal antibody
molecules. [J]-J PharmSci.2011;100:5115-5125.[15]Haberger M, Bomans
K, Diepold K, et al. Assessment of chemicalmodifications of sites in
the CDRs of recombinant antibodies:Susceptibility vs. functionality of
critical quality attributes.[J].MAbs.2014;6:327-339.[16]Du Y, Walsh
A, Ehrick R, et al. Chromatographic analysis of theacidic and basic
species of recombinant monoclonal antibodies.[J].MAbs.
2012;4:578-585.[17]Ponniah G, Kita A, Nowak C, et al.
Characterization of theacidic species of a monoclonal antibody using
weak cation exchangechromatography and LC-MS.
[J].AnalChem.2015;87:9084-9092.[18]He XA, Washburn N, Arevalo E,
et al. Analyticalcharacterization of IgG Fc subclass variants
throughhigh-resolution separation combined with multiple
LC-MSidentification. [J].Anal Bioanal Chem.2015;407:7055-7066.[19]LI
M Z,HAN W D,XING G H,et al- Research of N TerminalSequencing Methods
for Monoclonal Antibody Pharmaceuticals Blockedby Pyroglutamic
Acid.[J]- Chin Biotechnol J,201333 :73-80-[20]Houde D, Arndt
J,Domeier W ,et al.Characterization of IgG1Conformation and
Conformational Dynamics by Hydrogen/DeuteriumExchange Mass Spectrometry.
[J]-Anal. Chem.2009,81,2644−2651.[21]Houde D, Nazari ZE,
Bou-Assaf GM, et al. ConformationalAnalysis of Proteins in Highly
Concentrated Solutions byDialysis-Coupled Hydrogen/Deuterium Exchange
MassSpectrometry.[J]-J Am Soc Mass
Spectrom.2016;27:669-676.[22]Resetca D, Wilson DJ. Characterizing
rapid, activity-linkedconformational transitions in proteins via
sub-second hydrogendeuterium exchange mass
spectrometry.[J]-FEBSJ.2013;280:5616-5625.[23]Bagal D,
Valliere-Douglass J F, Balland A ,et al. Resolvingdisulfide structural
isoforms of IgG2 monoclonal antibodies by ionmobility mass spectrometry.
[J]-Anal. Chem.2010,82,6751−6755.[24]Valeja, S. G.; Kaiser, N.
K.; Xian, F.; Hendrickson, C. L.;Rouse,J. C.; Marshall, A. G. Unit
mass baseline resolution for anintact148 kDa therapeutic monoclonal
antibody by Fourier transformion cyclotron resonance mass spectrometry.
[J]-Anal.Chem.2011,83,8391−8395.[25]Li X J,Wang F Q,Xu W,et al.
Disulfide bond assignment of anIgG1 monoclonal antibody by LC -MS with
post-column partialreduction [J]- Analy Biochem,2013436
:93-100-[26]Yuan L,Arnold M E,Aubry A F,et al- Simple and
efficientdigestion of a monoclonal antibody in serum using
pelletdigestion:comparison with traditional digestion methods in
LC-MS/MS bioanalysis [J]- Bioanalysis,20124 :2887-96-[27]Li X, Xu
W, Paporello B, Richardson D, et al- Liquidchromatography and mass
spectrometry with post-column partialreduction for the analysis of
native and scrambled disulfide bonds.[J]-Anal Biochem.
2013;439:184-186.

同时,该方法在非治疗性抗体试剂的定点偶联和标记方面也具有广泛的应用价值,利用Fc糖链定点偶联技术可以避免标记修饰对抗体Fab区域的影响,克服随机偶联对抗体抗原识别造成的实验差异。

然而,非内部ADC在某些情况下可能会显示重要的毒性,会经常引起强烈的“旁观者效应”。未来设计必须考虑细胞毒性药物和抗体在整个ADC的抗肿瘤活性和毒性特征中的相对作用。

黄蔚课题组长期从事蛋白糖基化调控、细胞表面糖链编辑、糖结构药物等方向的研究。该文章的第一作者为其课题组的研究生唐峰,马里兰大学教授Lai-Xi
Wang为第二作者,中科院受体结构与功能重点实验室成员、中科院分子细胞科学卓越创新中心青年骨干成员黄蔚为通讯作者。该研究项目得到中组部“青年千人”计划、国家自然科学基金、中科院“个性化药物”先导科技专项的资助。

  1. 用于临床ADC的弹头

文章链接

目前正在进行临床试验的ADC,大多数靶向DNA或微管,并且已经高效优化。由于肿瘤细胞表面上抗原数量有限且ADC的平均药物与抗体比仅限于3.5-4,即ADC转入肿瘤细胞的药物量很低,合并细胞毒性药物的ADC可能因此造成临床失败。

相关文章

No Comments, Be The First!
近期评论
    功能
    网站地图xml地图